设计：随机对照观察实验。
时间及地点：于2011年6月至2012年6月在福建中医药大学中西医结合研究所完成。
材料：
实验动物：清洁级4周龄SD大鼠4只，10周龄SD大鼠40只，体质量250-300 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号：SYXK(沪)2007-0005。实验过程中对动物的处置方法符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
实验方法：
桂枝加葛根汤含药血清制备：桂枝加葛根汤按《伤寒论》原方：葛根12 g，桂枝9 g，芍药9 g，生姜9 g，甘草6 g，大枣12枚，麻黄9 g，由福建中医药大学附属第二人民医院制剂中心一次性加工完成，制成含生药0.66 g/mL浓缩液，4 ℃保存备用。选用成年清洁级10周龄SD大鼠40只，按随机数字表法分为2组，分别为桂枝加葛根汤组和空白组，每组20只。根据人鼠用药量及体表面积换算得出灌胃量。2组灌胃方法如下：空白组以2 mL生理盐水灌胃；桂枝加葛根汤组以4 mL桂枝加葛根汤药液灌胃，每天1次，连续灌胃4 d。于末次灌胃2 h后乙醚吸入麻醉，于腹主动脉及心脏采血，3 000 r/min离心20 min，吸取上层血清，经56 ℃，水浴30 min灭活。用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20 ℃保存备用。
细胞干预培养液：空白组为含生理盐水SD大鼠血清15 mL加DMEM培养基85 mL；桂枝加葛根汤组为含桂枝加葛根汤SD大鼠血清15 mL加DMEM培养基85 mL。
大鼠纤维环细胞体外培养与传代[9]：4周龄SD大鼠称质量后脱颈处死，用体积分数75%乙醇浸泡5 min，常规铺巾，切取脊柱，切取纤维环，用无血清的DMEM液冲洗椎间盘纤维环，剪碎，并收集至无菌离心管。弃上清，于PBS中1 000 r/min离心5 min，洗涤2遍。加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液，将其吹打成单细胞悬液，接种到25 cm2细胞培养瓶，每瓶接种5 mL。接种细胞置37 ℃、体积分数5%CO2、95%湿度的恒温CO2培养箱中培养。3 d后首次全量换液，以后每3 d全量换液1次。12 d后原代细胞铺满瓶底，弃培养液，PBS洗涤2遍。每瓶加入0.25%的胰蛋白酶联合0.02% EDTA消化液2 mL，静置3-5 min。倒置显微镜观察，待细胞触角收缩变圆后，加入2 mL含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移液器吹打成细胞悬浮液。移入离心管1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液吹打均匀，以5×107 L-1的浓度接种到25 cm2一次性培养瓶中，每瓶接种5 mL。
将大鼠纤维环用眼科剪将组织剪成1 mm3组织块，再用PBS漂洗2遍，800 r/min×2 min离心，收集沉淀。用0.25%胰蛋白酶消化液重悬组织，37 ℃消化10-15 min，终止消化，800 r/min×2 min离心，去上清，沉淀用无血清培养液清洗2次；沉淀中加入0.1%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化，待组织大部分消化、培养液浑浊后停止消化。1 000 r/min×5 min离心，收集沉淀。稀释细胞至1×108 L-1，接种细胞到100 mL塑料培养瓶中，生长培养液为DMEM(含体积分数10%胎牛血清、20 mmol/L HEPES，pH 7.2)，置于37 ℃、饱和湿度、含体积分数5%CO2的孵箱中培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，3 d换液1次。当细胞接近90%汇合时进行传代。弃掉培养液，用0.01 mol/L PBS洗涤细胞2次，弃掉液体。沿瓶壁加入数滴含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合消化液，晃动培养瓶，镜下观察消化情况。镜下见细胞皱缩、间隙加大、个别细胞变圆漂浮时立即用含血清培养液3 mL终止消化；用滴管轻轻吹打细胞数次制成细胞悬液。悬液1 000 r/min×5 min离心，弃上清，培养液混悬细胞后按1∶2接种。传3代后进行以下实验。
纤维环细胞的鉴定：
形态学鉴定：光镜观察细胞的形态。
纤维环细胞甲苯胺蓝染色：将传代细胞接种在放有预处理盖玻片的6孔培养板中进行细胞爬片，细胞爬片成功后，去除培养液，PBS冲洗3遍，40 g/L多聚甲醛室温固定 20 min；PBS冲洗，滴加甲苯胺蓝染液，室温30 min；自来水冲洗数秒；冰醋酸液分化数秒；蒸馏水洗2次，冷风吹干；二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察，拍照记录。
纤维环细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色：将第3代传代纤维环细胞，以2×104/cm2接种在放有预处理盖玻片的6孔培养板中进行细胞爬片，爬片成功好，吸掉培养液，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤2次；40 g/L多聚甲醛室温固定20 min；0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤，5 min×3次；体积分数3%双氧水室温30 min以封闭内源性过氧化物酶；0.01 mol/L PBS洗涤，5 min×3次；每片滴加正常山羊封闭血清30 μL，37 ℃孵育30 min；分别滴加Ⅰ型胶原单抗(1∶200稀释)、Ⅱ型胶原单抗(1∶200稀释)，保湿状4 ℃过夜；阴性对照试验：以抗体稀释液代替一抗。滤纸吸掉多余一抗，0.01 mol/L PBS洗涤5 min×3次；加入二抗约400 μL，37 ℃孵育60 min；甩掉多余液体，0.01 mol/L PBS洗涤5 min×3次；加入SABC复合物适量，37 ℃ 20 min；0.01 mol/L PBS洗涤5 min×4次；加入数滴置的DAB(1 mL ddH2O依次加入A、B、C液各1滴，混匀)，室温暗处显色，显微控制显色程度，约5 min，吸掉多余液体；自来水洗涤2次，甩掉多余液体；脱水、透明，中性树胶封固。显微镜下观察，拍照记录。
纤维环细胞药物干预：传3代纤维环细胞随机分为桂枝加葛根汤组和空白组。桂枝加葛根汤组分别加入含药血清的培养液(1 L培养基中含200 mL含药血清)；空白组加入含生理盐水血清的培养液(1 L培养基中含200 mL含生理盐水血清)。置37 ℃、体积分数5%CO2、95%空气的CO2培养箱中干预6 d后，细胞达到70%-80%铺满瓶底时，用0.02%EDTA及0.25%胰蛋白酶联合消化，用含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1 000 r/min离心10 min，收集细胞。用10 mL PBS以1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，细胞沉淀，反复冻融3次裂解，3 000 r/min离心10 min，收集上清液。
蛋白的提取：清空2组培养瓶中的培养基后，分别用4 ℃预冷的0.1 mol/L PBS洗涤3次，再将细胞小心刮下，转移至洁净1.5 mL离心管中，离心后弃去上清液。每管中加入200 μL 0.5 mol/L裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.1%PMSF，65 mmol/L DTT)，超声波破碎仪处理(超声条件：常规的人或者小鼠细胞超声70-75 W，超声5 s停10 s，超声3-5次)，冰上放置40 min，低温高速离心 (14 000 r/min，4 ℃离心30 min)后，取上清液。用bradford方法测定各组蛋白的浓度后，-80 ℃保存备用。
同位素标记相对和绝对定量技术标记：取2组样品各100 μg进行如下处理：每管各加入预冷的丙酮(丙酮∶样品体积比=5∶1)，-20 ℃沉淀1 h。12 000 r/min离心15 min，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液(20 μL)和1%SDS(1 μL)充分混悬溶解样品。加入还原试剂2 μL，60 ℃反应60 min。加入半胱氨酸封闭试剂1 μL，室温处理10 min。按照酶∶蛋白质=1∶20的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解过夜。113，118，119各管标记试剂中加入50 μL异丙醇(试剂盒中自带)，混匀，分别加入各管样品中，室温反应1 h，之后各加入3倍体积水，使标记试剂分解。标记和样品对应关系如下：空白组(IT118)、桂枝加葛根汤组(IT115)。合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。
脱盐：采用Sep-Pak Vac C18小柱脱盐。即将标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐，以便于后续分析。 ①100%乙腈冲洗柱子3次。②0.1%TFA (水溶)，冲洗柱子3次。③用400 μL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上。 ④0.1%TFA冲洗柱子3-5次。⑤用50%乙腈0.1%TFA 400 μL洗脱下样品。将样品冷冻干燥后进行后续分析。
第一维强阳离子柱(SCX)分离：第一维强阳离子柱分离：流动相A液含10 mmol/L KH2PO4和25%ACN，pH 2.6；B液含10 mmol/L KH2PO4、350 mmol/L KCl和25%ACN，pH 2.6。将冻干样品溶解于80 μL A液并全部上样。设紫外检测波长为214 nm/280 nm，流速为200 μL/min。线性梯度洗脱程序为：5-40 min，5%-25%B；40-45 min，25%-80%B；45-50 min，80%B；50-60 min，0%B。根据峰形和时间共收取20个梯度，真空离心浓缩后，每馏分用50 μL反相液相色谱的A相溶解，进样量20 μL。进行第二维分析。
第二维反相液质联用RPLC-MS：第二维反相液相色谱：流动相A液为体积分数为5%乙腈和0.1%甲酸溶液，流动相B液为体积分数为95%乙腈和0.1%甲酸溶液。流速：300 nL/min。RPLC柱线性梯度洗脱程序为：0-5 min，上样；5-90 min，5%-35%B；90-95 min，35%-80%B；95-100 min，80%B；100-105 min，80%-5%B；1 200 min停止。
质谱鉴定：纳喷雾针直接连接于反相色谱柱末端作为喷雾接口，喷雾电压2.2 kV。MS扫描范围400-1 800 U，一个谱图选择4个最强的母离子进行串级扫描，MS/MS扫描范围100-2 000 U。
数据库搜索：所得串级质谱分析数据用Protein Pilot 3.0对IPIv 3.45 mouse数据库进行检索，得到肽段和蛋白质鉴定信息，种属选择是大鼠，根据软件对鉴定到的蛋白质打分，对应蛋白质的假阳性率为5%。软件依据同位素报告基团的相对含量进行蛋白质定量，以空白组为对照，选择差异显著(P ≤ 0.05)的结果报告。实验采用2为标准差为有意义。所以蛋白平均比值大于2或小于0.5被认为有明显表达改变。
主要观察指标：运用同位素标记相对和绝对定量技术标记2组样本的蛋白，二维液相色谱质谱仪(2D LC-MS/MS)鉴定蛋白并进行相对定量分析。
.jpg)